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No Canadá de 1845, o jovem James Howlett vê seu seu pai John Howlett ser assassinado pelo caseiro da casa onde moravam, Thomas Logan, pai de Victor Creed. Apavorado, James desenvolve sua mutação: garras ósseas crescem entre as juntas de suas mãos e acaba matando Thomas, que antes de morrer revela que é seu verdadeiro pai. James foge junto com Victor para a floresta, e lá os dois prometem cuidar um do outro. Os irmãos passam os anos seguintes combatendo em diversas guerras para controlar suas tendências violentas, como a Civil Americana e ambas as Guerras Mundiais. Durante a Guerra do Vietnã, Victor tenta estuprar uma vietnamita, e é impedido por um superior e acaba matando-o. James tenta ajudá-lo, e os dois são "executados" por fuzilamento, e são aprisionados após a regeneração de ambos fazê-los sobreviver.
O cientista militar William Stryker procura os dois para participarem da Equipe X, um grupo de mutantes comandado pelo coronel no qual participam o atirador Agente Zero, o ágil lutador e mercenário Wade Wilson, o invulnerável Fred Dukes, o teleportador John Wraith e o manipulador de energia Chris Bradley. Porém, a negligência e as ações questionáveis do grupo, faz com que James o abandone, deixando Victor intrigado e decepcionado.
Seis anos depois, James está nas montanhas canadenses com o nome de Logan, trabalhando como lenhador e vivendo com sua namorada Kayla. Um dia ele é procurado por Stryker, que avisa que os antigos membros da equipe estão sendo mortos. Logo depois Kayla é assassinada por Victor e em um confronto Logan é derrotado pelo irmão. Logan procura Stryker atrás de ajuda para vencer o Victor. Em um projeto secreto, "Arma X", Stryker reforça o esqueleto de Logan comAdamantium, uma liga de metal virtualmente indestrutível. Antes do procedimento, Logan pede dog tags com o nome "Wolverine". Após a operação, Stryker diz para apagarem a memória de Logan - mas Wolverine escuta e foge. Wolverine se esconde num celeiro, onde conhece um casal idoso, Travis e Heather Hudson, que oferecem abrigo a Logan. No dia seguinte os dois são assassinados pelo Agente Zero, que persegue Wolverine. Logan consegue matar os homens de Zero e o próprio após derrubar o helicoptero.
Wolverine vai até seus ex-colegas Espectro e Dukes em Las Vegas. Um Dukes grandemente obeso conta que Victor está capturando mutantes para Stryker com a finalidade de fazer experimentos. Stryker está localizado em uma instalação secreta conhecida como "A Ilha", do qual apenas uma pessoa fugiu - Remy LeBeau, o Gambit. Logan e Espectro vão para Nova Orleans atrás de LaBeau. Wolverine pergunta a localização da Ilha, mas Gambit acha que ele é um dos homens de Stryker e o ataca. Do lado de fora do bar, Logan vê que Victor matou Espectro e tirou uma amostra de seu sangue. Os irmãos brigam, mas são interrompidos por Gambit. Victor foge, enquanto após um breve confronto, Gambit decide que Wolverine é sincero e decide levá-lo para a instalação de Stryker em Three Mile Island.
Na fortaleza de Stryker, Wolverine descobre que Kayla está viva - ela se aliou com Stryker para que ele libertasse sua irmã Emma, que está presa na ilha junto com outros mutantes - e também que ela Kayla tem o poder de persuasão. Kayla tenta convencer Logan que realmente o amava, mas o mutante frustrado a deixa. Quando Stryker nega o tratamento com adamantium para Victor, este fica furioso e ataca Kayla, mas Wolverine escuta os gritos dela e a salva. Wolverine derrota Victor, mas desiste de matá-lo, quando Kayla lembra Logan que ele não é um animal. Os dois então vão libertar os mutantes presos.
Stryker então envia Deadpool que é na verdade Wade, um soldado desenhado para matar mutantes, com diversos poderes pilhados de outros da espécie. Deadpool aparece na frente do grupo que foge e Wolverine decide combatê-lo enquanto o grupo segue por outro caminho. Quando Wolverine está prestes a ser derrotado por Deadpool no alto da torre de resfriamento, Victor aparece para ajudá-lo, e os dois irmãos vencem a Deadpool decapitando-o. Mesmo com a ajuda do irmão, Logan diz não mudar nada entre os dois e diz que terminaram, mas antes de fugir Victor repete a mesma frase que lhe disse quando era criança: “Nunca terminaremos. Somos irmãos, Jimmy. E irmãos se protegem”. O prédio cai e quase esmaga Wolverine, mas ele é salvo por Gambit. Logan então pede a Gambit para conferir se os mutantes fugitivos estão seguros. Kayla e os outros mutantes fogem, porém num ataque de guardas Kayla é baleada e decide ficar para trás. Os prisioneiros, guiados por um Scott Summers vendado seguindo uma voz em sua cabeça, descobrem do lado de fora o professor Charles Xavier que resgata todos e os leva para sua escola. Gambit vê a cena e vai avisar a Wolverine.
Logan descobre que sua amada foi baleada e tenta levá-la, mas o Stryker o acerta com balas de Adamantium e desmaia. Stryker se prepara para matar Kayla, mas ela usa seus poderes para fazê-lo desistir e sair andando antes de falecer de suas feridas.
Gambit volta, mas Wolverine está sem memória devido aos danos cerebrais causados pelas balas. Enquanto a polícia e ambulância chegam, Gambit tenta convencer Logan a ir com ele, mas Wolverine diz a Gambit que consegue se virar sozinho. Gambit deseja boa sorte e os dois fogem.
Durante os créditos, Stryker é capturado longe dali por militares por ter assassinado um general em Three Mile Island. Depois dos créditos, uma cena aparece dependendo da cópia: uma tem Wolverine em um bar oriental, "bebendo para lembrar", e a outra tem Deadpool na torre destruída, tentando tocar sua cabeça decepada.
